REAGENSIA UNTUK UJI KARBOHIDRAT

Larutanreagensia ialah suatu larutan yang dibuat untuk digunakan sebagai pereaksi pengenal. Larutan reagensia untuk uji karbohidrat adalah pereaksi yang digunakan untuk mengetahui adanya karbohidrat. Misalnya larutan Molisch, digunakan dalam uji Molisch pada penentuan wol dan karbohidrat. Larutan Benedict, digunakan untuk menentukan glukosa, demikian pula dengan reagen Tollen dan juga Millon. Dalam bab ini akan dijelaskan satu persatu, serta bagaimana cara menyiapkannya.

Reagen Molisch

Reagen Molisch digunakan dalam uji Molisch (Molisch berasal dari nama ahli botani Austria, yaitu Hans Molisch) ialah suatu ujikimia yang sensitif untuk mengetahui adanya karbohidrat, berdasarkan pada dehidrasi karbohidrat oleh asam sulfat untuk menghasilkan aldehid, yang berkondensasi dengan dua molekul fenol (biasanya alfa-naftol, meskipun fenol lain (misalnya resorsinol, timol) juga memberikan hasil berwarna), yang menghasilkan suatu senyawa berwarna merah atau ungu.

Pembuatan Larutan Molisch

Reagensia ini terdiri dari alfa-naftol dan alkohol atau kloroform. Reagen ini digunakan untuk uji wol dan karbohidrat. Reagen ini mudah dibuat di laboratorium. Cara membuatnya, larutkan 5 gram alfa-naftol dalam 100 ml alkohol atau kloroform.

Prosedur Uji

Larutan uji ini dikombinasikan dengan sejumlah kecil reagen Molisch (α-naftol dilarutkan dalam etanol atau kloroform) dalam sebuah tabung reaksi. Setelah bercampur, sejumlah kecil asam sulfat pekat dengan perlahan ditambahkan melalui dinding ke dalam tabung reaksi yang dimiringkan, tanpa pengadukan, yang membentuk suatu lapisan di dasar tabung. Reaksi dikatakan positif jika ditunjukkan oleh penampilan cincin ungu pada antarmuka  antara lapisan asam dan lapisan uji.

Reaksi

Semua karbohidrat – monosakarida, disakarida, dan polisakarida  – akan memberikan reaksi positif, dan asam nukleat dan glikoprotein juga memberikan reaksi positif, karena semua senyawa tersebut akhirnya terhidrolisis menjadi monosakarida oleh asam mineral kuat. Pentosa kemudian terhidrasi menjadi furfural,sedangkan heksosa terhidrasi menjadi 5-hidroksi-metilfurfural. Salah satu dari aldehida ini, jika ada, akan berkondensasidengan dua molekul naftol untuk membentuk produk berwarna ungu, seperti yang digambarkan di bawah ini dengan contoh glukosa.

Reagen Benedict

Reagen Benedict (juga disebut larutan Benedict) ialah suatu reagen kimia yang dinamakan berdasarkan nama ahli kimia Amerika, yaitu  Stanley Rossiter Benedict.

Reagen Benedict digunakan sebagai satu uji atas adanya gula reduksi. Ini meliputi semua monosakarida dan banyak disakarida, termasuk laktosa dan maltosa.Bahkan lebih umum, uji Benedict akan mendeteksi adanya aldehid, dan alfa-hidroksi-keton, termasuk yang terjadi sebagai keton tertentu. Jadi, meskipun ketosa fruktosa bukan suatu glua reduksi langsung, namun ia merupakan suatu alfa-hidroksi-keton, dan memberikan uji positif karena ia diubah menjadi aldosa glukosa dan mannosa oleh basa dalam reagen ini.

Tembaga sulfat dalam larutan Benedick bereaksi dengan gula reduksi. Larutan Benedik dapat digunakan dapat digunakan untuk mengetahui apakah ada gula dalam suatu zat seperti glukosa dalam pati lamo atau pati akar lalang.

Reagen Benedict mengandung ion tembaga(II) (Cu²⁺) biru yang direduksi menjadi ion tembaga(I) (Cu⁺). Ini diendapkan sebagai tembaga(I) oksida berwarna merah yang tidak larut dalam air. Reagen Benedict memberikan suatu uji kuantitatif untuk gula reduksi bersama dengan uji kuantitatif. Warna dari endapan yang diperoleh memberikan satu ide tentang kuantitas gula yang ada dalam larutan. Suatu endapan kehijauan menunjukkan konsentrasi sekitar 0,5%; endapan kuning konsentrasi 1%; jingga menunjukkan konsentrasi 1,5% dan merah menunjukkan konsentrasi 2% atau lebih tinggi.

Pembuatan Larutan Benedict

Satu liter reagen Benedict dapat dibuat dari 100 gr natrium karbonat anhidrat, 173 gr natrium sitrat dan 17,3 gr tembaga(II) sulfat mentahidrat. Larutan ini sering digunakan di tempat larutan Fehling.

Cara membuatnya, dengan bantuan pemanasan, larutkan 173 gr natrium sitrat dan 100 gr natrium karbonat anhidrat dalam 800 ml Akuades. Saring dan encerkan sampai volume larutan 850 ml. Larutkan pula 17,3 gr CuSO₄.5H₂O dalam 100 ml akuades (bila perlu dipanaskan). Bila larutan di atas sudah dingin, dengan perlahan-lahan tambahkan larutan CuSO₄ tersebut ke dalam larutan campuran karbonat dan sitrat. Kemudian encerkan dengan akuades hingga 1 liter.

Uji Kimia

Untuk menguji atas adanya monosakarida dan gula reduksi disakarida dalam makanan, sampel makanan dilarutkan dalam air, dan tambahkan sedikit reagen Benedict. Panaskan dalam penangas air, biasanya selama 4–10 menit, larutan ini akan membentuk warna biru (bila tidak mengandung glukosa), hijau, kuning, jingga, merah, dan kemudian merah bata atau coklat (jika mengandung glukosa tinggi. Perubahan warna akan signifikan dengan adanya glukosa. Disakarida umum laktosa dan maltosa dideteksi secara langsung oleh reagen Benedict, karena masing-masing mengandung satu glukosa dengan mereduksi bagian aldehid bebas, setelah isomerisasi.

Sukrosa(gula meja) mengandung dua gula (fruktosa dan glukosa) bergabung melalui ikatan glikosidat mereka dengan cara demikian mencegah glukosa berisomerisasi menjadi bentuk aldehid, atau fruktosa menjadi bentuk alfa-hidroksi-keton.  Dengan demikian, sukrosa bukan gula reduksi, karena tidak bereaksi dengan reagen Benedict. Secara tak langsung sukrosa meng-hasilkan hasil positif dengan reagen Benedict asalkan dipanaskan dengan asam sulfat encer sebelum uji tersebut, meskipun setelah perlakuan ini ia tidak lagi menjadi sukrosa.

Kondisi asam dan panas memutuskan ikatan glikosida dalam sukrosa melalui hidrolisis. Produk dekomposisi sukrosa adalah glukosa dan fruktosa, keduanya dapat dideteksi dengan reagen Benedict, seperti yang dijelaskan di atas.

Kanji tidak bereaksi atau bereaksi sangat sedikit dengan reagen Benedict, karena relatif kecil jumlah bagian gula reduksi, yang terjadi hanya pada akhir rantai karbohidrat. Inositol (mio-inositol) adalah karbohidrat lain yang meng-hasilkan uji negatif.

Reagen Benedict dapat digunakan untuk uji atas adanya glukosa dan urin. Glukosa ditemukanterdapat dalam urin merupakan indikasi diabetes mellitus. Setelah gula pereduksi terdeteksi dalam urin, uji lebih lanjut harus dialami untuk memastikan gula apa yang terdapat. Hanya glukosa merupakan indikasi diabetes.

Eksperimen	Pengamatan	Gangguan
Zat dalam air + 3 ml larutan Benedict, kemudian didih-kan selama beberapa menit dan biarkan dingin.	Endahpan merah/hijau/kuning diperoleh.	Gula reduksi, misalnya  adanya glukosa.
Zat dalam air + 3 ml Larutan Benedict, kemudian didihkan selama beberapa menit dan biarkan dingin.	Larutan tetap jernih atau sedikit biru.	Gula reduksi tidak ada.

Reagen Kuantitatif

Reagen Benedict kuantitatif digunakan untuk menentukan berapa banyak adanya gula reduksi. Larutan ini membentuk seperti endapan putih yang lebih baik dari endapan merah dan juga dapat digunakan dalam titrasi. Titrasi ini harus diulang dengan larutan glukosa 1% bukan sampel untuk kalibrasi.

Larutan Fehling

Larutan Fehling ialah suatu larutan yang digunakan dalam uji kimia untuk membedakan antara karbohidrat larut dalam air dan gugus fungsional keton, dan sebagai suatu uji untuk monosakarida. Uji ini dikembangkan oleh ahli kimia Jerman Herman von Fehling pada tahun 1849.

Pembuatan Larutan Fehling

Larutan Fehling selalu dibuat segar di laboratorium.  Larutan ini semula dibuat sebagai dua larutan yang terpisah, yang dikenal dengan Fehling A dan Fehling B. Fehling A adalah larutan encer berwarna biru dari tembaga(II) sulfat, sedang Fehling B adalah larutan jernih dari kalium natrium tartrat encer (jugas dikenal sebagai garam Rochelle) dan basa kuat (biasanya natrium hidroksida).

Volume yang sama dari dua campuran dicampurkan untuk memperoleh larutan final Fehling, yang berwarna biru gelap. Dalam campuran akhir ini, ion tartrat encer dari khelat garam Rochelle yang terlarut dengan ion  Cu²⁺ dari tembaga(II) sulfat yang terlarut, sebagai ligan bidentat memberikan kompleks bis-tartrato-kuprat(II)^4- seperti yang ditunjukkan di bawah ini. Ion tartrat, dengan mengomplekskan tembaga mencegah pembentukan  Cu(OH)₂ dari reaksi CuSO₄.2H₂O dan NaOH yang ada dalam larutan.

Jadi cara membuat larutan ini adalah:

Larutan Fehling A: Timbang 69,3 gr kupri sulfat hidrat CuSO4.5H2O dan larutkan dalam 1 liter akuades. Supaya larutan menjadi jernih tambahkan 1 tetes atau 2 tetes H2SO4 pekat.. Perbandingan dapat diperbesar atau diperkecil.

Larutan Fehling B: Timbang 346 gr Kalium-Natrium-Tartrat dan 100 gr NaOH larutkan dalam 1 liter akuades (perbandingan dapoat diperbesar atau diperkecil). Bila akan digunakan Fehling A + Fehling B dalam volume yang sama.

Kegunaan Larutan Fehling

Fehling dapat digunakan untuk menentukan apakah suatu senyawa mengandung karbonil aldehid atau keton. Kompleks bistartratokuprate(II) dalam larutan Fehling merupakan bahan pengoksidasi dan reagen aktif dalam uji tersebut.

Senyawa yang akan diuji ditambahkan ke larutan Fehling dan campuran ini dipanaskan. Aldehida yang teroksidasi, memberikan hasil yang positif, namun keton tidak bereaksi, kecuali mereka adalah alfa-hidroksi–keton.

Kompleks bistartratokuprat(II) mengoksidasi aldehid pada satu anion karboksilat, dan dalam proses ion tembaga(II) dari kompleks ini direduksi menjadi ion tembaga(I). Oksida tembaga(I) yang merah kemudian mengendap dari campuran reaksi, yang menunjukkan hasil positif, yaitu reaksi redoks telah berlangsung (ini adalah hasil positif yang sama dengan larutan Benedict).Sebuah hasil yang negatif apabila tidak terjadi endapan merah; ini penting untuk diperhatikan bahwa Fehling tidak akan bekerja dengan aldehid aromatik; sehingga reagen Tollens harus digunakan.

Uji Fehling dapat digunakan sebagai uji generik untuk monosakarida. Hal ini akan memberikan hasil positif untuk monosakarida “aldosa” (karena gugus aledehida dapat dioksidasi) tetapi juga untuk monosakarisa “ketosa”, karena mereka diubah menjadi aldosa oleh basa dalam reagen tersebut, dan kemudian memberikan hasil positif. Untuk alasan ini, reagen Fehling kadang-kadang disebut sebagai uji umum untuk monosakarida.

Reagen Fehling dapat digunakan untuk menunjukkan  glukosa dalam urin, sehingga mendeteksi diabetes. Penggunaan lainnya adalah dalam pemecahan pati untuk mengubahnya menjadi sirup glukosa dan maltodekstrin untuk mengukur jumlah gula pereduksi, sehingga dapat mengungkapkan setara dekstrosa (DE) dari gula pati.

Asam format (HCOOH ─ asam metanoat) juga memberikan hasil uji Fehling yang positif, karena ia juga berfungsi seperti uji Tollens dan Benedict. Ini karena ia dapat dioksidasi dengan mudah menjadi CO₂ dan air.

Keamanan

Natrium hidroksidaadalah  kaustik pada konsentrasi tinggi dan tindakan pencegahan harus diambil seperti untuk tidak melakukan kontak langsung dengan NaOH. Tembaga (II) sulfat juga beracun jika tertelan.

Reagen Tollens

Reagen Tollens ialah reagen kimia yang paling umum digunakan untuk menentukan apakah suatu senyawa mengandung karbonil yang adalah aldehida dan keton. Ini biasanya adalah perak nitrat amoniakal, tetapi juga dapat berupa campuran lain, asalkan adanya kompleks perak(I)diamina. Reagen ini dinamakan sesuai dengan penemunya, ahli kimia Jerman Bernhard Tollens.

Uji positif dengan reagen Tollens dihasilkan dengan pengendapan unsur perak dari larutan, sebenarnya pada permukaan dalam dari tabung reaksi, yang menghasilkan “cermin perak” yang karakteristik dan mudah diingat di atas permukaan tabung reaksi sebelah dalam.

Aldehida akan menjadi positif dalam uji Tollens dan benda seperti cermin akan terbentuk.

Pembuatan di Laboratorium

Reagen ini tidak tersedia secara komersial karena daya tahannya tidak lama; reagen ini harus disiapkan secara segar di laboratorium. Cara pembuatannya meliputi dua tahap. Pertama beberapa tetes NaOH encer ditambahkan kepada sejumlah perak nitrat encer. Dalam larutan ini, ion Ag⁺ dari perak nitrat encer terdapat dalam bentuk terhidratkan sebagai kompleks  [Ag(H₂O)₄]⁺, yaitu ion tetraaquasilver(I).  Ion OH^– dari NaOH bereaksi dengan ion  Ag⁺ untuk menghasilkan perak oksida, Ag₂O. Ini tidak larut, dan mengendap dari larutan sebagai zat padat coklat. Natrium nitrat encer juga dihasilkan dalam campuran sebagai hasil-samping. Ini kemudian membentuk:

2 AgNO₃ (aq) + 2 NaOH (aq) → Ag₂O (s) + 2 NaNO₃ (aq) + H₂O (l)

Pada tahap selanjutnya, ammonia encer ditambahkan hingga semua dari perak(I) oksida) yang berwarna coklat terlarut. Pada titik ini campuran akan jernih, dan sekarang ada ion perak encer yang terdapatsebagaikompleks [Ag (NH₃)₂]+  dalam campuran, yang merupakan komponen utama dari reagen Tollens. Natrium hidroksida direformasi pada akhir persiapan. NaOH terbentuk kembali pada sediaan akhir.

Ag₂O (s) + 4 NH₃ (aq) + 2 NaNO₃ (aq) + H₂O (l) →

 

2Ag(NH₃)₂NO₃ (aq) + 2 NaOH (aq)

Atau, amonia encer dapat ditambahkan secara terus– menerus langsung ke larutan perak nitrat.Pertama kali, perak oksida akan terbentuk dan mengendap, tetapi karena larutan ammonia lebih banyak ditambahkan endapan melarut dan larutan menjadi jernih karena terbentuknya diamminesilver(I). Pada titik ini penambahan ammonia harus dihentikan. Ini barangkali metoda yang lebih baik karena lebih sedikit reagen yang terlibat. Penyaring-an reagen sebelum digunakan membantu untuk mencegah hasil positif palsu.

Cara membuat larutan Reagen Tollens sebagai berikut:

Larutan-I: Campurkan 7 mL NH₃ (aq) 27% dengan aquadest, hingga volume larutan menjadi 100 mL.

Larutan-II: 20 mL larutan AgNO₃ 5%.

Larutan-III: 10 tetes NaOH 10%.

Lalu Larutan-II dan III dicampurkan; setiap 2 mL Larutan-II ditambahkan 1 tetes Larutan-III, sehingga terjadi endapan abu-abu (campuran-IV). Kemudian ditambahkan Larutan-I ke dalam campuran-IV, namun jangan sampai berlebih. Hasil ini disebut Reagen Tollens. Digunakan untuk uji aldehida dan gula pereduksi.

Penggunaan Analitik

Setelah ini telah dipastikan bahwa ada gugus karbonil pada molekul organik menggunakan 2,4-dinitrofenilhidrazin (juga dikenal sebagai pereaksi Brady atau 2,4-DNPH), reagen Tollens dapat digunakan untuk menentukan apakah senyawa ini keton atau aldehida. Yang penting, ada hal khusus di mana reagen Tollens  akan memberikan hasil positif untuk keton, jika keton merupakan keton alfa-hidroksi, maka reagen Tollens akan bereaksi.

Pengujian didasarkan pada premis bahwa aldehida lebih mudah teroksidasi dibandingkan dengan keton, hal ini karena karbon yang mengandung karbonil dalam  aldehida memiliki satu hidrogen yang terikat. Kompleks diamminesilver(I) dalam campuran adalah zat pengoksidasi dan merupakan reaktan penting dalam reagen Tollens. Uji ini umumnya dilakukan dalam tabung reaksi dalam penangas air hangat.

Pada uji positif, kompleks diamminesilver(I) mengoksidasi  aldehida menjadi ion karboksilat dan dalam proses ini direduksi menjadi unsur perak dan ammonia encer. Unsur perak yang meng-endap dari larutan, sebenarnya pada permukaan dalam tabung reaksi, yang memberikan “cermin perak” yang karakteristik.

Ion karboksilat pada pengasaman akan memberikan hubungannya dengan asam karboksilat. Asam karboksilat tidak terbentuk secara langsung di tempat pertama karena reaksi berlangsung di bawah kondisi basa.Persamaan ion untuk seluruh reaksi ditunjukkan di bawah ini. R adalah gugus alkil.

[Ag(NH₃)₂]⁺ (aq) + e⁻ → Ag (s) + 2 NH₃ (aq)

RCHO (aq) + 3 OH⁻ → RCOO⁻ + 2 H₂O + 2 e⁻

Hasil negatif untuk uji ini tidak mengendapkan perak yang terbentuk ketika karbonil yang diuji ditambahkan. Keton akan memberikan hasil negatif karena keton tidak dapat dioksidasi dengan mudah. Keton tidak mengandung atom hidrogen yang terikat pada karbon karbonil, artinya keton tidak dapat dengan mudah dioksidasi—kecuali aldehida, yang mengandung atom hidrogen ini.

Reagen Tollens juga satu uji untuk alkuna dengan ikatan rangkap-tiga pada posisi-1. Endapan kuning dari logam asetilida terbentuk dalam kasus ini.

Baik reagen Tollens maupun reagen Fehling juga memberi-kan hasil positif dengan asam format (asam metanoat – HCOOH), yang teroksidasi sepenuhnya menjadi air dan CO₂.

Dalam patologi anatomi, perak nitrat ammoniakal digunakan dalam Fontana-Masson Stain, yang merupakan satu teknik noda perak yang digunakan untuk mendeteksi melanin, argentaffin dan lipofuscin dalam bagian jaringan. Melanin dan chromaffin lainnya mereduksi perak nitrat untuk logam perak.

Pada Pembentukan Cermin Perak

Reagen Tollens juga digunakan untuk menerapkan cermin perak pada perangkat kaca (glassware), misalnya di dalam labu vakum yang berisolasi. Sekitar 500 mL larutan disiapkan, jauh lebih banyak dibandingkan yang akan dibuat untuk penggunaan analitik. Ini kemudian diperkenalkan ke permukaan kaca bersih yang menjadi cermin dan larutan mereduksi menggunakan larutan glukosa. Untuk kualitas tinggi menyelesaikan permukaan kaca dibersihkan menggunakan asam pengoksidasi untuk menghilang-kan semua jejak senyawa organik dan permukaan kaca pra-perlakuan dengan timah (II) klorida encer.

Uji Tollens untuk Pentosa

Uji ini yang lain dipercaya atas reaksi furfural dengan floglusinol yang menghasilkan senyawa berwarna dengan absorp-tivitas molar yang tinggi.

Keamanan

Reagen ini harus dibuat segar dan disimpan dalam wadah kaca gelap dan berpendingin. Reagen ini hampir tahan sampai 24 jam bila disimpan dengan cara ini. Setelah uji telah dilakukan, campuran yang dihasilkan diasamkan dengan asam encer sebelum dibuang.  Kewaspadaan adalah untuk mencegah pembentukan perak nitrida yang sangat eksplosif.***