METODA ANALISIS LIPID, GLIKOGEN DAN GULA PADA SERANGGA

Pendahuluan

Metoda ini menentukan kandungan lipid, glikogen, dan gula dari seekor serangga tunggal. Ini memiliki keuntungan bahwa hasil yang wajar dapat dicapai dengan hanya beberapa ekor serangga, yang mungkin sangat signifikan di lapangan.

Pemisahan lipid, glikogen dan gula lebih penting karena sejumlah besar gula dikonsumsi, seperti yang diberikan melalui larutan makanan di laboratorium atau sumber gula seperti nektar dan melon yang tertelan di alam, dapat mengganggu analisis lipid (uji pewarnaan biru/ungu dari vanillin).

Juga, uji anthrone panas tidak membedakan antara gula tertelan dalam tanaman dan karbohidrat yang sudah ditransfer ke bentuk penyimpanan glikogen.

Homogenisasi dengan larutan natrium sulfat akan membantu untuk bersama-mengendapkan glikogen setelah penambahan larutan kloroform-metanol, dimana lipid dan gula larut, penambahan air memungkinkan pemisahan gula dan lipid (gula dalam fase atas dan lipid dalam fase yang lebih rendah). Hati-hati saat menangani kloroform dan asam.

Perhatikan bahwa untuk serangga yang lebih besar, Anda harus menggunakan nilai yang berbeda kloroform / etanol (2,8 ml bukan 1,6 ml) dan air (2 ml bukan 0,6 ml), sisanya adalah sama.

 

Bahan-bahan

  • Tabung sentrigugal kaca
  • Glass grinding pestle atau batang pengaduk
  • Balok pemanas pada 90 – 110 oC
  • Labu relenmeyer
  • Centrifuge

Reagensia

  • Asam sulfat (95-98%)
  • Anthrone
  • Glukosa anhidrat
  • Natrium sulfat
  • Metanol
  • Minyak nabati yang tersedia secara komersial (mis. Minyak kedelai)
  • Vanillin
  • Asam fosfat (85%)
  • Kloroform

Larutan

  • Larutan Na2SO4 2%
  • Campuran kloroform-metanol 1:1 (v/v)
  • Reagen Vanillin-Asam fosfat
  1. Larutkan 600 mg vanillin dalam 100 mL air panas deionisasi.
  2. Tambahkan 400 mL asam fosfat 85%.
  3. Simpan dalam gelap. Stabil selama beberapa bulan tetapi buang jika larutan sudah gelap.
  4. Tambahkan 385 mL asam sulfat (95-98%) ke dalam 150 mL air deionisasi.
  5. Larut 750 mg anthrone
  6. Simpan pada suhu 4 oC. Stabil selama beberapa minggu.
  • Reagen anthrone

Standar

  • Lipid: 100 mg per 100 mL minyak nabati komersial (misalnya minyak kedelai) dalam kloroform.
  1. Dalam tiga rangkap, tambahkan 50, 100, 200 dan 400 μl larutan ke dalam tabung kaca.
  2. Tempatkan dalam balok pemanas pada suhu 90-110oC untuk menguapkan pelarutnya.
  3. Tambahkan 0,2 mL asam sulfat dan panaskan selama 10 menit pada suhu 90-110 oC.
  4. Tambahkan vanillin sampai 5 mL dan campurkan.
  5. Pindahkan dari balok pemanas dan biarkan dingin.
  6. Biarkan terbentuknya warna kemerahan; ini akan menghabiskan waktu 5 menit dan akan stabil sampai 30 menit.
  7. Tentukan OD pada panjang gelombang 625 nm dan plotkan μg lipid vs. OD untuk jalur kalibrasi.
  8. Dalam tiga rangkap, tambahkan 25, 50, 100, 150 dan 200 μl larutan glukosa ke dalam tabung kaca.
  9. Tambahkan reagen anthrone sampai 5 mL dan campurkan.
  10. Panaskan selama 17 menit pada suhu 90-110 oC.
  11. Pindahkan dari balok pemanas dan biarkan dingin.
  12. Tentukan OD pada panjang gelombang 625 nm dan plotkan μg glukosa vs. OD untuk standar kalibrasi.
  • Gula dan glikogen: 100 mg per 100 mL glukosa anhidrat dalam air deionisasi.

Ekstraksi Fraksi Lipid, Glikogen dan Gula dari Nyamuk

  • Masukkan nyamuk ke dalam tabung kaca sentrifuge.
  • Tambahkan 0,2 mL larutan natrium sulfat.
  • Homogenkan nyamuk dalam larutan hingga tidak ada bagian tersisa yang dapat diidentifikasi (batang kaca atau alat lain).
  • Cuci batas kaca ke dalam tabung sentrifuge dengan dua kali 0,8 mL volume larutan kloroform/metanol.
  • Sentrifugasikan (3000 rpm, 1 menit).
  • Pindahkan supernatant ke dalam tabung sentrifugasi yang bersih.  Tahan pellet untuk analisis glikogen.
  • Tambahkan 0,6 mL air deionisasi untuk supernatant. Campurkan.
  • Sentrifugasikan (3000 rpm, 1 menit).
  • Pisahkan fraksi atas (air/metanol) untuk analisis gula.
  • Porsi bawah (kloroform) gunakan porsi ini untuk analisis lipid.

Analisis Lipid

  • Tempatkan porsi untuk analisis lipid dalam sebuah tabung dengan menandai pada tingkat 5 mL.
  • Tempatkan dalam balok pemanas pada suhu 90-110 oC untuk menguapkan pelarutnya.
  • Tambahkan 0,2 mL asam sulfat dan panaskan selama 10 menit pada 90-110 oC.
  • Tambahkan reagen vanillin sampai tingkat 5 mL dan campurkan.
  • Pindahkan dari balok pemanas dan biarkan sampai dingin.
  • Biarkan terbentuknya warna kemerahan; ini akan berlangsung sampai 5 menit dan akan akan stabil sampai 30 menit.
  • Tentukan OD pada panjang gelombang 625 nm.

Analisis Gula

  • Tempatkan porsi untuk analisis gula dalam sebuah tabung bertanda 5 mL.
  • Tempatkan dalam balok pemanas pada suhu 90-110 oC untuk menguapkan pelarut sampai tinggal 0,1 – 0,2 mL.
  • Tambahkan reagen anthrone sampai 5 mL dan campurkan.
  • Panaskan selama 17 menit pada suhu 90-110 oC.
  • Pindahkan dari balok pemanas dan biarkan sampai dingin.
  • Tentukan OD pada panjang gelombang 625 nm.

Analisis Glikogen

  • Tambahkan reagen antrone sampai 5 mL dan campurkan.
  • Panaskan selama 17 menit pada suhu 90-110 oC.
  • Pindahkan dari balok pemanas dan biarkan sampai dingin.
  • Tentukan OD pada panjang gelombang 625 nm.

Metosa analisis ini Diadaptasikan dari (Van Handel 1985a; Van Handel 1985b; Van Handel dan Day 1988; Kaufmann and Brown 2008). ***

 


Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s