REAGENSIA UNTUK UJI PROTEIN

DALAM artikel ini kita akan membahas dua jenis reagensia yang lazim digunakan untuk uji protein. Reagensia tersebut ialah Biuret dan Millons. Bagaimana cara menyiapkan larutan reagensia tersebut di laboratorium, selengkapnya akan diuraikan di bawah ini.

Reagen Uji Biuret

Reagen Biuret ialah suatu uji yang digunakan untuk membuktikan keberadaan gugus kimia ikatan peptida dalam protein. Uji ini memberikan warna ungu dengan adanya zat kimia ini. Reagen ini adalah campuran senyawa anorganik yang disebut kalium hidroksida, kalium natrium tartrat, dan tembaga sulfat.

Tegasnya, uji Biuret ialah uji kimia yang digunakan untuk melacak adanya ikatan peptida. Dengan adanya peptida, ion tembaga(II) membentuk kompleks koordinasi berwarna-ungu dalam larutan alkalis atau basa. Beberapa varian tentang uji ini telah dikembangkan, seperti uji BCA dan uji Lowry yang dimodifikasi.

Reaksi Biuret dapat di-gunakan untuk menentukan konsentrasi protein karena ikatan peptida terjadi dengan frekuensi yang sama per asan amino dalam peptida. Inten-sitas warna, dan karena itu absorpsi pada panjang gelom-bang 540 nm, berbanding langsung dengan konsentrasi, sesuai dengan hukum Beer-Lambert.

Terlepas dari namanya, reagen ini pada kenyataannya tidak mengandung biuret ((H2N-CO-)2NH). Uji ini dinamakan demikian karena juga memberikan reaksi positif terhadap ikatan peptida-seperti dalam molekul biuret.

Prosedur

Sampel encer yang diperlakukan dengan basa kuat 1% (NaOH atau KOH) dengan volume yang sama diikuti dengan beberapa tetes tembaga(II) sulfat encer. Bila larutan berubah ungu, itu berarti adanya protein. 5–160 mg/mL dapat ditentukan. Suatu peptida dengan panjang rantai sekurang-kurangnya 3 asam amino diperlukan untuk pergeseran warna terukur signifikan dengan reagen ini.

Reagen Biuret

Reagen Biuret dibuat dari KOH/NaOH dan tembaga(II) sulfat hidrat, bersama dengan kalium natrium tartrat. Kalium natrium tartrat ditambahkan untuk kompleks dan menyetabilkan ion kupri. Reagen berubah dari biru ke ungu dengan adanya protein, biru ke merah jambu (pink) ketika bergabung dengan polipeptida rantai-pendek.

Tidak semua uji Biuret memerlukan reagen biuret. Reagen ini umumnya digunakan dalam penentuan protein biuret, penentuan kolorimetrik yang digunakan untuk menentukan konsentrasi protein—seperti UV-VIS pada panjang gelombang 540 nm (untuk melacak ion Cu2+).

Cara Pembuatan Reagen Biuret

Cara pembuatan larutan Biuret di laboratorium sebagai berikut:

  • Larutan-A: Larutkan 440 gr NaOH dalam 1 liter akuades.
  • Larutan-B: Larutkan 25 gr CuSO4.5H2O dalam 1 liter akuades.
  • Untuk uji Biuret: Ke dalam larutan (sampel) yang diperiksa, tambahkan 1 mL larutan-A, kemudian tambahkan 1 tetes larutan-B. Jika ada protein, maka terbentuklah warna ungu atau violet.

Varian Uji Biuret Sangat Sensitif

Dua jenis utama uji biuret yang umum diterapkan dalam analisis peptida kolorimetrik modern: Uji Bicinchoninic Acid (BCA) dan uji Lowry Modifikasi bergantung pada pembentukan kompleks kelat berwarna ikatan peptida dan ion tembaga.

Pada uji BCA ini, Cu+ membentuk kompleks ungu gelap dengan BCA, yang memungkinkan protein ditentukan dalam kisaran 0,0005 – 2 mg/mL. Uji ini sering disebut “uji Pierce” sesuai dengan produsen kit reagen. Ion kupri berkoordinasi dengan 4 ikatan peptida, yang mereduksinya menjadi ion kupro dan memungkinkan ia membentuk kompleks dengan BCA yang menyerap sekitar 540 nm, menghasilkan menghasilkan warna. Uji protein dengan BCA meningkatkan kepekaan uji biuret dengan faktor sekitar 100, dan memberikan manfaat penting kompatibi-litas dengan sampel yang mengandung sampai 5% surfaktan. Hal ini dicapai dengan kelasi asam bisinkoninat (bicinchoninic acid) dengan ion tembaga yang dibentuk oleh reaksi biuret. Hal ini meningkatkan sensitivitas karena  BCA/kompleks tembaga larut air menyerap jauh lebih kuat daripada peptida/kompleks tembaga.

Uji protein Lowry yang dimodifikasi menggunakan mekanisme serupa dengan uji protein BCA; protein direaksikan dengan tembaga(II) sulfat untuk menghasilkan kompleks tembaga tetradentat, dan larutan asam fosfotungstat ditambahkan, agar dapat direduksii dengan kompleks yang menyerap sangat kuat pada 650-750 nm.

Uji Biuret juga merupakan cara mengikat aluminium oksida dan mengubah supernatant kuning seperti dalam oksidasi gula dan melepaskan satu gugus alydmne.

Cu+ adalah suatu zat pereduksi yang dapat bereaksi misalnya dengan Mo(VI) dalam reagen Folin-Ciocalteu untuk membentuk molibdenum biru. Dengan cara in, protein dapat terdeteksi dalam konsentrasi antara 0,005 dan 2 mg/mL. Molibdenum biru pada gilirannya dapat mengikat pewarna organik tertentu seperti hijau malakhit dan auramin O, sehingga   selanjutnya penguatan sinyal. Lihat juga uji protein Lowry – cara lain untuk menentukan konsen-trasi protein dalam suatu larutan.

Reagen Millon

Reagen Millon ialah suatu reagen analitik yang digunakan untuk mendeteksi adanya protein yang larut. Beberapa tetes reagen ini ditambahkan ke dalam larutan yang diuji, yang kemudian dipanaskan secara  perlahan-lahan. Pewarnaan coklat-kemerahan menandakan adanya residu tirosin yang terjadi di hampir semua protein:

Uji Millon tidak spesifik untuk protein (uji ini sebenarnya mendeteksi senyawa-senyawa fenol), dan begitu banyak yang dikonfirmasikan oleh uji-uji lain untuk protein seperti uji biuret dan reaksi ninhidrin.

Pembuatan Larutan Reagen Millon

Reagen ini di laboratorium dibuat dengan melarutkan logam merkuri dalam asam nitrat dan diencerkan dengan akuades. Uji ini dikembangkan oleh ahli kimia Prancis Auguste Millon (1812-1867).

Cara pembuatannya adalah sebagai berikut:

  • Millon-A: Tuangkan 100 mL H2SO4 pekat ke dalam 800 mL akuades sambil didinginkan. Geruslah 100 gr HgSO4 dalam sebuah lumpang (mortar) porselin dengan mencampurkan sedikit asam sulfat encer. Larutan yang terjadi dituangkan ke dalam labu ukur 1 Liter, dan encerkan sampai garis tanda, kemudian disaring.
  • Millon-B: Larutkan 5 gr NaNO3 dalam 500 mL akuades. Sebelum menggunakan, campurlah terlebih dulu dua bagian volume Millon-A dengan 1 bagian volume Millon-B. Tuangkan larutan ini ke dalam botol yang berwarna coklat atau hijau dan simpan pada suhu yang dingin.***

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s